活体单细胞显微技术成像可实时表征基于单细胞水平的生理变化，有助于揭示组织间的信号传输机制和细胞相互作用，对于预测和调控疾病进展至关重要的。然而，基于传统的可见和近红外光（NIR-I，<900 nm）显微成像面临严重的光衰减问题，活体显微通常需要在成像部位进行手术以暴露目的组织。然而这种手术开窗辅助成像不可避免地会改变局部血管通透性，诱发皮肤、肌肉或颅骨等组织炎症，诱发成像区域组织的微环境变化。

为此，复旦大学张凡教授研究团队率先开发了基于近红外第二窗口荧光（NIR-II，~1500 nm）的活体无创显微技术。张凡教授最新发表的Nature Protocols论文详细介绍了如何利用NIR-II纳米荧光探针进行活体显微成像，以避免在活体组织中的衰减，从而实现对深脑组织中的单细胞动态追踪，采用光学性能优异的稀土纳米探针ErNPs和TmNPs标记活体中的中性粒细胞，实现了对脑卒中小鼠脑皮层中中性粒细胞无创动态可视化和迁移行为分析。在这篇文章中，研究团队详细介绍了NIR-II显微成像用于活体动态细胞追踪的实验方案（图1），从NIR-II纳米荧光探针的设计合成与表征，多通道NIR-II显微成像设备的灵活搭建，活体标记细胞，NIR-II活体显微成像实验的前期准备与实时成像操作，数据分析等多方面进行了详细的介绍。

图1. 近红外二区活体荧光显微成像技术的工作示意图

其中，团队利用开发的新型近红外二区稀土荧光探针特异性的标记了小鼠的中性粒细胞以研究炎症血管中活化中性粒细胞的体内成像（图2）。中性粒细胞能够在血管内壁爬行到外渗部位，然后外渗是中性粒细胞活化的典型特征。CD11b是一种介导细胞粘附和迁移的中性粒细胞表面蛋白，在活化的中性粒细胞表面表达上调。中性粒细胞上Ly6G和CD11b蛋白的双重标记有助于在体内特异性地跟踪活化的中性粒细胞。因此，在缺血性脑卒中小鼠模型中，静脉注射抗ly6g抗体偶联的α-TmNPs和抗cd11b抗体偶联的α-ErNPs (α-Er-aCD11b)，标记活化的中性粒细胞，双标记的中性粒细胞表现出微弱的运动、滚动和爬行，表明它们在内皮细胞表面粘附牢固。此外，可以观察到双标记的中性粒细胞，沿着血流的剪切力被拉长，这通常被认为是中性粒细胞通过炎症血管外渗的最后一步。

图2. 炎症血管中活化中性粒细胞的体内成像。

最后，本文对基于NIR-II荧光活体显微设备和技术的适用范围和应用前景进行了总结与展望，致力于将NIR-II荧光显微技术推广于脑科学、感染科学、免疫与炎症、肿瘤、干细胞等生物医学科学的基础研究应用中。

参考文献

Ying Chen, Yiwei Yang, and Fan Zhang*. Noninvasive In Vivo Microscopy of Single Neutrophils In The Mouse Brain Via NIR-II Fluorescent Nanomaterials. Nature Protocols, 2024. DOI: doi.org/10.1038/s41596-024-00983-3.