高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography 简称 HPLC）是一种用途广泛、分析能力极强的色谱技术，在药物生产和研究的许多方面都有应用。它根据物质的分子结构和成分，将混合物分离或识别为不同的成分。
引言
HPLC 应用最广泛的分离技术。它非常灵敏、特异和精确。
- 它是柱层析的一种特殊形式，用于生物化学和分析，以分离、鉴定和量化混合物中的活性化合物。
- 在 HPLC 上有填料（固定相），泵使流动相通过色谱柱，检测器显示分析物的保留时间。
- 保留时间是可变的，主要取决于固定相、分析物和所用溶剂之间的相互作用。
- 少量待分析样品被引入流动相流，并通过与固定相的特定化学或物理相互作用而被保留
- 保留取决于分析物的性质以及固定相和流动相的成分。
- 高效液相色谱法（HPLC）最常用的溶剂是甲醇和乙腈。
原理
高效液相色谱法（HPLC）是将少量液体样品注入装有微小颗粒（直径为 3 至 5 um，称为固定相）的管子中，样品中的单个成分随着通过泵输送的高压液体（流动相）通过色谱柱进入装有颗粒的管子。
柱填料用于将成分相互分离。这涉及到其分子与填料颗粒之间的各种化学和/或物理相互作用。
分离出来的成分会在色谱柱出口处被检测器检测到，检测器会测量这些成分的含量。检测器的输出称为 "液相色谱图"。
图 1. 描述了高效液相色谱法的基本原理。步骤 1.引入样品（流动相）。步骤 2.将样品分离成各种成分（固定相）。步骤 3.将样品分离成各组分（流动相）。
与低压柱液相色谱法相比的优势
与传统的低压柱液相色谱法相比，高效液相色谱法（HPLC）有许多优势。
- 灵敏度更高（可使用各种检测器）
- 更高的分辨率
- 速度更快
- 便于样品回收（移除的流动相更少）
- 多种固定相可适用
分支
色谱法分为气相、液相和超临界流体技术。气相色谱法又分为气-液技术和气-固技术。
液相色谱法分为薄层色谱法等相对较多的技术。加压液相色谱法又可分为离子交换色谱法、排阻色谱法、分配色谱法和液固色谱法。
液相色谱法分为薄层色谱法等相对较多的技术。加压液相色谱法又可分为离子交换色谱法、排阻色谱法、分配色谱法和液固色谱法。
图 2.描述色谱法的分支。
类型
HPLC 的以下变体取决于工艺中的相系统（固定相）。
1. 正相高效液相色谱法
又称正相色谱法或吸收色谱法。这种方法根据极性分离分析物。它有一个极性固定相和非极性流动相。因此，固定相通常为二氧化硅，典型的流动相为正己烷、二氯甲烷、氯仿、二乙醚和混合物。该技术适用于对水敏感的化合物、几何异构体、顺反异构体、类别分离和手性化合物。
2. 反相高效液相色谱法
固定相为非极性（疏水性），流动相为水性、中等极性。它的工作原理是疏水相互作用，因此材料的非极性越强，保留时间就越长。这种技术适用于非极性、极性、可电离和离子分子。
3. 体积排阻高效液相色谱法
又称凝胶渗透色谱法或凝胶过滤色谱法。色谱柱中填充有精确控制孔径的材料，颗粒根据分子大小被分离。较大的分子迅速通过色谱柱；较小的分子则穿过多孔填料颗粒，随后洗脱出来。体积法还有助于确定蛋白质和氨基酸的三级和四级结构。它还可用于测定多糖的分子量。
4. 离子交换高效液相色谱
在这种色谱法中，保留是基于溶质离子与固定相上的带电位点之间的吸引力。带相同电荷的离子会被排除在外。这种技术可用于纯化水、蛋白质的配体和离子交换色谱、碳水化合物和低聚糖的高 pH 阴离子交换色谱等。
5. 生物亲和高效液相色谱
在这类色谱中，分离是基于蛋白质与配体的可逆相互作用。
组成
图片系统的核心是进行分离的色谱柱。
1. 溶剂储液器：玻璃储液器中含有流动相内容物。高效液相色谱法中的流动相或溶剂通常是极性和非极性液体成分的混合物，其各自的浓度根据样品的成分而变化。
2. 泵：泵将流动相从溶剂储液器中吸出，并迫使其通过系统的色谱柱和检测器。根据色谱柱的尺寸、固定相的粒度、流速和流动相的成分等因素，工作压力最高可达 42000 kPa（约 6000 psi）。
3. 样品进样器：进样器可以是单次进样，也可以是自动进样系统。用于高效液相色谱系统的进样器应能在高压（高达 4000 psi）条件下对体积在 0.1-100 mL 范围内的液体样品进行进样，并具有较高的重现性。
4. 色谱柱：色谱柱通常由抛光不锈钢制成，长度在 50 至 300 毫米之间，内径在 2 至 5 毫米之间。色谱柱通常填充粒径为 3-10 微米的固定相。内径小于 2 毫米的色谱柱通常称为微孔色谱柱。理想情况下，流动相和色谱柱的温度在分析过程中应保持恒定。
5. 检测器：高效液相色谱检测器位于色谱柱的末端，在分析物从色谱柱洗脱出来时对其进行检测。常用的检测器有紫外光谱检测器、荧光检测器、质谱检测器和电化学检测器。
6. 数据收集装置：检测器发出的信号可收集到图表记录器或电子积分器上，它们的复杂程度和处理、存储和再处理色谱数据的能力各不相同。计算机将检测器对每种成分的响应进行整合，并将其放入色谱仪中，以便于读取和解释。
应用
高效液相色谱法可获得的信息包括化合物的分辨、鉴定和定量。它还有助于化学分离和纯化。高效液相色谱的其他应用包括
- 制药应用：控制药物稳定性。药物剂型的片剂溶出度研究。药品质量控制
- 环境应用：检测饮用水中的酚类化合物。污染物的生物监测。
- 法医学应用：生物样本中的药物定量。鉴定血液、尿液等中的类固醇。纺织品染料的法医分析。测定血液、尿液等中的可卡因和其他滥用药物。
- 食品和香料：软饮料和水的质量测定。果汁中的糖分分析 蔬菜中多环化合物的分析。防腐剂分析。
- 在临床检验中的应用：尿液分析、血液中的抗生素分析。肝脏疾病中胆红素和胆绿素的分析。检测脑细胞外液中的内源性神经肽等。
原文发表于：High Performance Liquid Chromatography (HPLC) : Principle, Types, Instrumentation and Applications - Laboratoryinfo.com..
